肽圖檢查法鑒定蛋白質結構

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本法系通過蛋白酶或化學物質裂解蛋白質后,采用適宜分析方法鑒定蛋白質一級結構的完整性和準確性

 

第一法:胰蛋白酶裂解 -反相高效液相色譜法

按照高效液相色譜法測定

色譜條件:以蛋白質與多肽分析用辛烷基硅烷鍵合硅膠或十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑:以0.1%三氟乙酸的水溶液為流動相A液以0.1% 三氟乙酸的乙腈溶液為流動相B液,流速為每分鐘1ml,梯度洗脫70分鐘(A液從100% ?30%B液從 0? 70% )

柱溫 30°C±5°C,

對照品與供試品保存溫度 2? 8°C

檢測波長 214nm

檢査法:取供試品溶液及對照品溶液(均為每lml中含lmg的溶液,如供試品和對照品濃度不夠,則應濃縮至相應的濃度),分別用1 % 碳酸氫銨溶液充分透析,按 1:50(mg /mg)加入胰蛋白酶溶液取[ 苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理過的(或序列分析純)胰蛋白酶適量,加 1% 碳酸氫銨溶液溶解,制成每lml中含 0.lmg的溶液]到供試品溶液與對照品溶液中,于37℃保溫16 ? 24小時后,按1:10加入50 %醋酸溶液,以每分鐘10000轉離心5分鐘(或用0.45μm 濾膜濾過),精密量取上清100μl,分別注入液相色譜儀,梯度洗脫,記錄色譜圖。將供試品溶液的圖譜與對照品溶液的圖譜進行比較即得。

 

第二法:溴化氰裂解法

檢査法:取供試品與對照品適量(約相當于蛋白質50μg),用水透析16小時,冷凍干燥,加溴化氰裂解液[稱取溴化氰0.3g,加甲酸( 70%— 100%lml使溶解]20μ1溶解,室溫放置24小時,裂解物加水180μl,再冷凍干燥。凍干的裂解物用水復溶至適當濃度。照SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法( 膠濃20%)進行電泳,用銀染法染色。將供試品圖譜與對照品圖譜進行比較即得

 

 

2019年11月5日 11:17
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