重組腸激酶如何溶解,酶切條件如何?

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1)使用pH和緩沖液體系是什么?

pH=8,緩沖液體系為25mM Tris-HCl

 

2)融合蛋白的使用量?

融合蛋白濃度0.1-1mg/ml(蛋白總量50-100µg),使用量為0.1-0.2U。每1U可酶切500µg融合蛋白。

 

3)酶切溫度和酶切時間?

酶切溫度為25℃,過夜酶切,或完全酶切需12h-16h

 

4)咪唑存在是否影響酶切?

咪唑含量在100mM以下,NaCl濃度在50mM以下,甘油濃度小于5%以下進行酶切,酶的用量與蛋白的比例不變(即1U酶切500µg蛋白)。

 

5)影響酶切的條件有哪些?如何解決?

在>200mM 咪唑,或>200mMNaCl,或>5%甘油,酶切效果受影響。可參照以下推薦方法進行酶切:

1)為獲得理想酶切結果,請將樣品透析到25mM Tris-HCl 8.0緩沖液中,再進行酶切。

2)若不便透析,可將樣品稀釋,咪唑含量在100mM以下,NaCl濃度在50mM以下,甘油濃度小于5%以下進行酶切,酶的用量與蛋白的比例不變(即1U酶切500µg蛋白)。

3)如果樣品溶液中含有上述成分中的一種或多種,且不便去除,此時適當增加酶量或延長酶切時間,也可達到較好酶切效果。

 

 

 

  

2019年11月5日 11:17
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