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重組羧肽酶B

重組胰蛋白酶酶聯免疫吸附測定試劑盒 使用說明書 (96T)K02-RPT

使用前請仔細閱讀說明書和提示部分。若有任何問題,請聯系我們。

 

 

1.試劑盒用途

本試劑盒用于體外定量檢測待測樣品中重組胰蛋白酶含量。本試劑盒僅供研究和工業生產使用。

 

2.試劑盒基本參數

靈敏度:≤ 1 ng/ml

檢測范圍:0.078 - 40 ng/ml

特異性:可檢測重組胰蛋白酶,與其它重組大腸菌表達系統相關蛋白無明顯交叉反應。

重復性:板內,板間變異系數均 < 10%

工作時間:熟練實驗人員可在 2.5 小時內完成一次測定。

有效期:6 個月

 

3.試劑盒組成及保存

未拆封的試劑盒可在 2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒,請拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。

 

中文名稱

規格

保存條件

凍干標準品 (A1)

Reference Standard

10ng/支×4

2-8

濃縮標準品&樣品稀釋液& HRP-抗體稀釋液(25 X(P1)

Concentrated Reference Standard & Sample Diluent &

Concentrated HRP- Ab Diluent (25x)

1 瓶×5 mL

2-8

濃縮洗滌液(25 X(P2)

Concentrated Wash Buffer (25x)

1 瓶×40 mL

2-8

底物稀釋液(TMB(P3)

Substrate Reagent

1 瓶×15 mL

2-8℃避光

反應終止液 (P4)

Stop Solution

1 瓶×5 mL

2-8

抗體包被的 ELISA 酶標板(96 孔,可拆卸)

MicroELISA Plate(Dismountable)

8 孔×12

-20

濃縮辣根過氧化物酶化抗體 (A2)

Concentrated HRP-Detection Ab

1 支×0.05mL

-20

顯色底物(TMB(A3) Substrate Reagent

5 支×0.125 mL

-20℃避光

封板覆膜(可重復使用)(Plate Sealer

5

/

產品說明書 (User Manual

1

/

質檢報告 (Certificate of Analysis

1

/

說明:

①所有試劑瓶須旋緊瓶蓋以防止蒸發和微生物污染。

②酶標板-20℃可存放 6 個月,2-8℃存放勿超過一周。

 

4.試驗所需自備物品

  • 酶標儀(濾光片波長 450 nm 650nm
  • 高精度移液器,EP 管及一次性吸頭,加樣槽
  • 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水
  • 潔凈無紙屑的吸水紙或干布
  •  

5.待測樣品注意事項

①樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于 2-8℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1 個月內檢測),或 -80℃(3 個月內檢測),避免反復凍融。

②試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍,如果樣品中檢測物濃度高于標準品最高值,請根據實際情況,做適當倍數稀釋后再測。

.若使用化學裂解液制備的樣本或細胞提取液,由于引入某些化學物質會導致 ELISA 測值出現偏差。

 

6.檢測前準備工作

①請提前 20 分鐘從冰箱中取出試劑盒平衡至室溫,觀察溶液是否有結晶,如果有結晶按提示進行操作。提前 15 分鐘打開酶標儀預熱。

②稀釋液配制

將濃縮標準品&樣品稀釋液&HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋(125)。

③洗滌液配制

將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(125)。

提示:從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正常現象,可用 40℃水浴加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過 50℃,使用時洗滌液溫度應為室溫)。請當日使用。

④標準品配制

將標準品于1000/分離心1分鐘后,加入標準品&樣品稀釋液 1.0 mL 至凍干標準品中,旋緊管蓋,靜置 10 分鐘后上下顛倒數次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為 10 ng/mL, 然后進行倍比稀釋(注:不要直接在反應孔中進行倍比稀釋)。建議配制成以下濃度:1052.51.250.630.3120.1560 ng/mL。標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/mL

提示:溶解和稀釋標準品過程中盡量避免產生氣泡。

倍比稀釋方法

7 EP 管,每管加入 500 μL標準品&樣品稀釋液,從 10 ng/mL 的標準品工作液中吸取 500 μL加入含有 500 μL標準品&樣品稀釋液的 EP 管中混勻配成 5 ng/mL 的標準品工作液,按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。

標準品稀釋圖例(以500 μL為例)

提示:最后一管直接作為空白孔,不再加入標準品工作液。

HRP-抗體工作液配制實驗前請先將抗體管1000/分離心1分鐘,以避免管壁及管蓋上殘留抗體。計算實驗所需抗體用量(以 100 μL /孔計算),實際配制時應多配制 100-200 μL工作液。使用前 15 分鐘,用 HRP-抗體稀釋液將濃縮辣根過氧化物酶化抗體稀釋為工作濃度(抗體:稀釋液 = 1

250),當日使用。

⑥顯色底物(TMB)工作液配制

計算實驗所需顯色底物用量(以 100 μL /孔計算),實際配制時應多配制 100-200 μL顯色底物工作液。使用前 15 分鐘,用底物稀釋液將 TMB 顯色底物稀釋為工作濃度(底物:稀釋液

=120),避光保存,當日使用。

提示:配制顯色底物(TMB)工作液要嚴格避免污染,如出現變藍的現象應重新配制。

 

7.洗板方法

①自動洗板機:每孔加入洗滌液 350-400 μL(根據加滿孔的標準進行調整),注入和吸出間隔 60 秒。

②手工洗板:甩盡孔內液體,在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干,每孔加入洗滌液 350-400 μL(根據加滿孔的標準進行調整),浸泡 2-3 分鐘,甩盡孔內液體,在潔凈無紙屑的吸水紙上拍干。

 

8.操作步驟

①將標準品工作液依次加入到前兩列孔中,每個濃度的工作液并列加兩孔(復孔),每孔 100 μL。待測樣品加入到其他孔,每孔 100 μL,若樣本濃度高于檢測范圍,需用標準品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標板覆膜并置于 37℃孵育 60 分鐘。

提示:加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動酶標板混勻避免產生氣泡。

加樣時間控制在10分鐘內。

②洗滌:甩盡孔內液體,在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。每孔加入 350-400 μL(根據加滿孔的標準進行調整)洗滌液,浸泡 2-3 分鐘,甩盡孔內液體,在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。重復此洗板步驟3次。

③每孔加入 HRP-抗體工作液 100 μL,輕輕晃動酶標板混勻避免產生氣泡,將酶標板覆膜并置于 37℃孵育 30 分鐘。

④洗滌:用洗滌液洗板 4 次,方法同步驟 2

提示:酶標板洗滌不完全可能會造成標準曲線梯度差,或背景值高。應注意加入洗滌液的體積,以加滿酶標板的孔為標準進行調整,確保所有的孔浸泡在洗滌液中并浸泡 2-3 分鐘。

⑤顯色:每孔加顯色底物(TMB)工作液 100 μL,酶標板覆膜置于 37℃ 孵育 10 分鐘。提示: 加顯色底物推薦使用排槍和加樣槽,但應嚴格避免底物污染,確保所使用的加樣槽潔凈或一次性使用,加液時移液槍的槍頭切不要接觸孔內溶液以避免污染,影響實驗結果。可通過觀察加樣槽中底物是否變藍預判底物是否被污染。根據實際顯色情況酌情縮短或延長,顯色時間在 5-30 分鐘范圍內。當標準孔出現明顯梯度時,即可終止。

⑥終止:每孔加終止液 50 μL,終止反應,室溫放置 1 分鐘。推薦使用排槍和加樣槽。

提示: 終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時移液槍的槍頭切不要接觸孔內溶液以避免污染,影響實驗結果。

⑦讀數:用酶標儀在 450 nm 波長(參考波長 650nm)測量各孔的光密度(OD450/650 nm 值)。

提示: 請提前 15 分鐘打開酶標儀電源,預熱儀器,設置檢測程序。

 

9.結果判斷

①計算每組復孔的平均 OD 值。每個標準品的平均 OD 值減去空白孔的 OD 值作為矯正值。以標準品的濃度為橫坐標(X),OD 值為縱坐標(Y),繪出標準曲線(作圖時亦可去掉空白組的值)。

②推薦使用專業的曲線制作軟件,如 curve expert 1.3 ELISA Calc(請使用 Logistic 五參數擬合曲線計算方法繪制標準曲線)等。

③若樣品 OD 值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測。

④典型數據由于實驗操作條件的不同(如操作者、移液技術、洗板技術和穩定條件等),標準曲線的

OD 值會有所差異。以下數據和曲線僅供參考實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

X- 濃 度

ng/mL

10

5

2.5

1.25

0.625

0.31

2

0.156

0

Y-OD450/650 nm

1.601

1.45

4

1.23

1

0.87

2

0.624

0.38

2

0.244

0.057

Y-OD450/650 nm

(去本底)

1.574

1.39

7

1.17

4

0.81

5

0.567

0.32

5

0.187

0

回收量

ng/mL

10.16

7

4.82

2

2.62

8

1.18

2

0.657

0.30

6

0.153

回收率%

101.7

96.4

105.

1

94.6

105.1

98.1

98.1

 

10.注意事項

①儲存:試劑盒中各種試劑請按說明書提示合理存放。儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發和微生物污染,否則可能會出現錯誤結果。

②酶標板:剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質,此為正常現象,不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用板條應拆下后放入備用自封袋,按推薦溫度存放。

③加樣:加樣和加同一試劑時,第一孔與最后孔之間加樣時間間隔過大將導致不同的“預溫育”時間,從而明顯的影響到測量值的準確性及重復性,每次的加樣時間最好控制在 10 分鐘之內,推薦設置復孔。

④溫育:為防止樣品蒸發,實驗時必須給酶標板覆膜,洗板后應盡快進行下步操作,避免酶標板處于干燥狀態。嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

⑤洗板:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙或干布上拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。讀數前要清除酶標板底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標儀讀數。

⑥試劑配制:試劑盒在運輸過程中會使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用 1000 /分離心一分鐘,以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請用移液器小心吹打 4-5 次使溶液混勻。

所有試劑請按說明書指示請精確配制。

⑦顯色時間的控制:加入底物后,請定時觀察反應孔的顏色變化(比如每隔五分鐘),如梯度已經很明顯,請提前加終止液終止反應,以避免顏色過深,影響酶標儀讀數。

⑧底物:請避光保存底物。在儲存和溫育時,避免強光直接照射。

⑨混勻:充分輕微混勻對反應結果尤為重要,最好使用微量振蕩器,使用最低頻率,如無微量振蕩器,可以在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

提示:不同批號的試劑盒組分不能混用(洗滌液和終止液除外)。

⑩關于樣品回收率

  1. 本試劑盒以測定重組豬胰蛋白酶的抗原性而非活力來推測殘留量,因此試劑盒中標準品

采用胰蛋白酶的消光系數(E1%1cm=13.6D, 即當 A280nm=1.36 時,胰蛋白酶濃度為 1mg/ml)來計算其蛋白含量,以最大限度保持質控的精確和穩定性。

  1. 不同計量方法以及產品純度的差別可以導致不同來源、不同批次產品中胰蛋白酶的蛋白含量不完全一致,也會造成回收率的差異。
  2. 為避免上述因素影響,建議將用作回收率測試的樣品采用分光光度法(A280nm)估算蛋白含量,再稀釋至適合的濃度用于回收率測試,盡量減少回收率的誤差。
  3.  

11.問題分析

若實驗結果有問題,請及時對顯色結果拍照,并妥善保存未使用板條及試劑,然后聯系技術支持。也可參考以下信息以找出原因。

 

問題描述

可能原因

相應對策

標準曲線梯度差

吸液或加液不準

檢查移液器和吸頭

標準品稀釋不正確

溶解標準品時稍微旋轉瓶身,輕輕混勻使粉末完全溶解

酶標板洗滌不完全

保證洗滌時間和洗滌次數及每孔的加液量

顯色很弱或無色

溫育時間太短

保證充足的溫育時間

實驗溫度不正確

使用推薦的實驗溫度

試劑體積不夠或漏加

檢查吸液及加液過程,保證所有試劑按順序足量添加

稀釋不正確

讀數數值低

酶標儀設置不正確

在酶標儀上檢查波長和濾光片裝置

提前打開酶標儀預熱

變異系數大

加液不正確

檢查加液情況

背景值高

檢測抗體的工作濃度過高

使用推薦的稀釋倍數

酶標板洗滌不完全

重新仔細閱讀操作步驟,保證每步清洗完全;如果用自動洗板機,請檢查所有的出口是否有堵塞;是否使用試劑盒配備的洗滌液。

洗液有污染

配制新鮮的洗液

靈敏度低

ELZSA試劑盒保存不當

按說明書要求保存相關試劑

讀數前未終止

OD讀數前應在每孔中加入終止液

 

 

 
 

 

  • 產品規格
    一套
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